Microbiologie
La microbiologie est la science qui étudie les micro-organismes.
Les micro-organismes sont un groupe très diversifié, ils existent à l'état de cellule isolée ou en groupe. Ils sont de petite taille.
Comment distinguer les cellules microbiennes des plantes ou des animaux ? Les cellules animales et végétal sont incapables de vivre à l'état isolé dans la nature ; elles sont toujours à l'état multicellulaire. Les virus ne sont pas des micro-organismes car ils ne sont pas autonomes, ils ne peuvent pas se reproduire sans détourner la machinerie cellulaire d'un autre individu.
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Historique
- Dès l'Antiquité, on postulait l'existence d'agents infectieux transmissibles invisibles à l'œil nu.
- 1546 : Jérôme Fracastor impute la transmission des maladies à des germes vivants, qu'il appelait « seminaria ».
- 1677 : Découverte des bactéries par le microscopiste hollandais Antoine van Leeuwenhoek.
- 1828 : Christian Gottfried Ehrenberg utilise pour la première fois le terme bactérie.
- 1840 : Le pathologiste allemand Jacob Henle propose une « théorie des germes » pour les maladies.
- 1857-1876 : Louis Pasteur met en évidence les rôles des micro-organismes dans la fermentation lactique et alcoolique. Il développe les techniques de pasteurisation et de stérilisation lui permettant la mise en place de cultures pures de micro-organismes. La possibilité de culture a permis de démontrer que la génération spontanée était une aberration.
- 1877-1895 : Louis Pasteur démontre que des maladies sont la conséquence de la présence de ces micro-organismes. Premières recherches systématiques sur l'origine de certaines maladies, ainsi que la vaccination.
- 1873-1882 : Robert Koch met au point en évidence le bacille responsable de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis). Koch a établi les règles (toujours utilisées) qui permettent de démontrer rigoureusement qu'une bactérie donnée est à l'origine d'une infection.
- 1884 : Hans Christian Gram développe une technique de coloration qui est la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et celles à Gram négatif.
- 1928 : Alexander Fleming découvre les propriétés antibactériennes de la pénicilline.
- 1940 : Selman Waksman découvre un autre antibiotique: la streptomycine.
- 1997 : Séquençage complet du premier génome bactérien (Escherichia coli). La microbiologie entre dans l'ère de la génomique.
Classification
L'analyse de la structure interne a permis de déterminer deux groupes de micro-organismes : les procaryotes et les eucaryotes
Les deux groupes se sont différenciés très tôt du point de vue phylogénétique.
Caractéristiques
Les procaryotes
- On retrouve les eubactéries dans notre quotidien, sol, nourriture...
- Les archéobactéries sont un groupe particulier car il ne comprend essentiellement que des espèces anaérobies (n'ayant pas besoin de dioxygène), vivants dans des environnements extrêmes : on parle d'organisme extrémophile. Les environnements extrêmes sont à la limite des conditions tolérées par les cellules biologiques (milieu salin très acide ou très alcalin, milieu à une température limite de l'ébullition). Les archéobactéries ne sont pas que des extrêmophiles, ce sont aussi des organismes plus communs qui vivent dans des conditions de vie classique comme les marais ou les rumens des ruminants. Il ne faut pas associer systématiquement archéobactéries à des organismes extrêmes même si on retrouve parmi eux la plupart des extrêmophiles.
Ces micro-organismes ont des mécanismes pour résister à ces conditions.
Les eucaryotes
Les eucaryotes ont un système membranaire interne enfermant des organites (noyau,plaste, mitochondrie...) ; ils présentent un cytosquelette interne (actine, tubuline) absent chez les procaryotes.
Protozoaire
Les protozoaires sont des êtres unicellulaires dépourvus de paroi cellulaire (contrairement aux algues). On en trouve dans le sol, l'eau douce, l'eau de mer, mais également comme parasites de l'homme et des animaux. Les protozoaires se nourrissent par pinocytose et endocytose car ils n'ont pas de paroi cellulaire.
Algue
Contrairement aux champignons et aux protozoaires, les algues ont des pigments chlorophylliens.
Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et l'eau de mer. Elles sont autotrophes.
Champignon
Les champignons sont présent dans le sol, plantes, débris végétaux, lichen, parasite de l'homme des animaux et des plantes.
- Remarque : une levure est un champignon eucaryote.
Les champignons sont abserbotrophes : ils sécrètent des enzymes qui digèrent à l'extérieur des polymères. Ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.
La taille des micro-organismes
Comme signalé au début, les micro-organismes sont de très petite taille (d'où leur nom) :
- bactérie: de l'ordre de 0,5 à 3 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur;
- eucaryote: très variable de 2 à 200 µm(pour la largeur), pas de limite en longueur;.
Le pouvoir séparateur de l'œil humain est de 100 µm, les micro-organismes sont donc invisibles à l'œil nu.
Le rapport surface sur volume directement influencé par la taille : si l'on considère une forme simple telle que la sphère, la surface est proportionnelle au carré de la taille (4πr2 si r est le rayon de la sphère), alors que le volume est proportionnel à cube de la taille (4/3πr3), le rapport surface/volume est donc proportionnel à r (3/r).
Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la nourriture passe à travers la membrane plasmique, donc la vitesse d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir est proportionelle au volume. La vitesse à laquelle entre et sorte les nutriments et les déchets est donc inversement proportionnel à la taille. Donc plus la bactérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à très grande vitesse (taux de croissance très rapide).
La culture des micro-organismes
Richesse du milieu
Les micro-organismes ont besoin :
- D'une source d'énergie.
- Pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés chimiques (par exemple du glucose)
- Pour les phototrophes, de la lumière.
- D'une source de carbone
- Pour les autotrophes, il suffit de CO2 atmosphérique (carbone minéral).
- Pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH4, oses...)
- De macroéléments (Ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu de culture)
- De microéléments
- D'une source d'azote
- D'origine minérale (sel d'ammonium)
- De facteurs de croissance
- De dioxygène
- Pour les aérobies stricts
- — ou —
- d'absence de dioxygène pour les anaérobies stricts ; pour ces micro-organismes, le peroxyde d'oxygène (H2O2) formé par la réaction entre l'O2 et l'H2O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase dégradant H2O2 à l'inverse des individus aérobies.
- De facteurs physico-chimiques
- Pour le facteur température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur optimum de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C.
Il faut descendre au-delà de -18 °C pour arrêter toute croissance microbienne. À 3 °C il n'y a plus de risque lié aux bactéries pathogènes ou toxinogènes. - Pour le facteur pH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide. (pH=5)
- Pour le facteur température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur optimum de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C.
Diversité du milieu de culture
On distingue deux sortes de milieu de culture :
- Synthétique : milieu dont on peut donner la composition chimique complète. Les milieux synthétiques sont utilisés en recherche fondamental.
- Empirique : milieu dont on ne connaît que partiellement la composition.
et parmi ces 2 types de milieu, il existe des milieux séléctifs (qui vont permettre de séléctionner le type de bactéries qui pourront cultiver dessus). Les milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellule de levure déshydraté et lysées) qui fournissent une source d'acide aminé de vitamine et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéine animale, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.
Ces milieux sont soit liquides, soit solides. On utilise fréquemment la gélose ou agar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à 60°C.
La stérilisation
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet, et ce de manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène).
Il existe trois façon pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploie de radiation et d'agent chimique (gaz)
La chaleur
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
Bec-bunsen.png
- Chaleur sèche :
- bec Bunsen : tout l'air qui se trouve dans les 10 cm est passé une fois dans la flamme. Ceci crée une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes travaillent avec une flamme oxydante qui crépite.
- Four pasteur : C'est un four classique utilisé à 180°C pendant 90 minutes.
- Chaleur humide
- Autoclave : cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la pression et donc dépasser les 100°C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Ceci est réalisé à 120°C pendant 20 minutes.
Cas particulier: la pasteurisation et tyndallisation
Cette technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne. Ce n'est en aucun cas une technique de stérilisation.
La tyndallisation est une série de chauffages bref à des températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Pour exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes.
L'ébullition n'est pas une méthode de stérilisation. les formes sporulées des bactéries résistent jusqu'à 8H30 à 100°C.
La filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm ; les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre. Pour forcer ce liquide à traverser le filtre on utilise deux solutions:
- mise en pression du liquide par l'intermédiaire d'un piston
- aspiration du liquide en créant par exemple une enceinte dépressurisé de l'autre coté du filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles (c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques.
Radiation et agent chimique
Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire. Elles sont très pénétrante car les radiations et les gaz traversent le plastique et tuent les micro-organismes.
Notion de culture pure
Technique des stries
Elle est basée sur la notion d'UFC (unité formant une colonie). Chaque unité cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va donner une colonie. Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries avec une forme particulière (la colonie). La forme de ce monticule est détermine par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement.
Technique de suspension dilution
Cette technique sert à évaluer le nombre de microorganismes qui se trouvent dans un miliieu liquide (eau de puit, boissons, eau de piscine...) ou dans un milieu solide (sol, aliments...). Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange. Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prélèvement d'un aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être séléctif ou non. Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (en générale 1mL sur une boîte), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu (on considère qu'1 UFC correspond à 1 bactérie).
Identification des bactéries
Critères morphologiques
L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.
Macroscopique
A l'œil nu on peut distinguer:
- la forme (ronde, entière, ondulé, zoné, filamenteuse...)
- La taille
- La couleur
- L'aspect (collant, filamenteux...)
- L'odeur
Microscopique
- Forme
- La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries dépourvues de paroi, qui peuvent être très polymorphes, la diversité est relativement restreinte pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi ces dernières, on distingue principalement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnante ou filamenteuses.
- Mode de groupement
- Elles peuvent se regrouper en chaîne (streptocoques, entérocoques, lactocoques...), en amas asymétriques ou grappes (staphylocoques), en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou paquets d’épingles (corynébactéries)... Le mode de groupement, à condition de l’apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et à condition de tenir compte de l’aspect prédominant, est également un élément important pour orienter l'identification.
- Taille
- Les plus petites bactéries ont une taille de 0,1 à 0,2 micromètre (Chlamydia) alors que certaine ont un diamètre supérieur à 10 micromètres. La plus grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un diamètre de 750 micromètre.
- Présence de spore
- Toute les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. Il faut noter que la totalité des bacilles gram+ sporulent en situation de stresse. Pour mettre en évidence les spores au microscope photonique, il suffit de les colorer au vert de malachite.
- Mobilité
- Les bactéries peuvent être équipé d'un ou plusieurs flagelle(s) leur permettant de ce déplacer.
- Capsule
- La capsule est un polysaccharide disposés en couche à la périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie d'adhérer au surface(coloniser les surfaces) et d'échapper au système immunitaire car les antigènes de surface sont recouvert par la capsule et les rends indétectables. (Pouvoir pathogène)
Critères biochimiques
critères génétiques
Les agents antibactériens
Les agents physiques
Ont peut citer les agents suivants :
- La chaleur : à partir de 65°C les protéines sont dénaturés, cependant certains micro-organismes sont capable de supporter des température plus élevée.
- Le pH qu'il soit trop acide ou trop basique
- Les hautes pressions : à partir de 6 000 bar, c'est avec un traitement par la pression que l'on stérilise les jus de fruits produit en industrie
- L'aW : moins il y a d'eau libre dans un milieu moins les bactéries pourront se develloper ( Staphylococcus aureus se develloppe à partir d'une Aw de 0.83 )
les agents chimiques
a suivre
Les antibiotiques
Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action spécifique avec un pouvoir destructeur sur les micro-organismes. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules. Ces molécules peuvent avoir une action drastique, c'est-à-dire bactéricide ou fongicide, leur efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des micro-organismes.(bactériostatique ou fongistatique)
Voir l'article détaillé Antibiotique.
Les résistances aux antibiotiques
Voir l'article Antibiotique > Les résistances aux antibiotiques.
La croissance bactérienne
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